L - arginine patch

+

Arginine-Rich Cationic Polypeptides Amplify lipopolysaccharide-Induced monocytes Activation Herbert Bosshart 1. 2 et Michael Heinzelmann 1. 1 Département de chirurgie, Hôpital universitaire, 8091 Zurich 2 Laboratoire de recherche en métabolisme du calcium, les départements de chirurgie orthopédique et de médecine, Hôpital universitaire, 8008 Zurich Suisse RÉSUMÉ la protéine cationique de CAP37 neutrophile humain dérivé, également connu sous azurocidin ou la protéine de liaison à l'héparine, améliore le lipopolysaccharide (LPS) induit par la libération de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a) dans les monocytes humains isolés. Nous avons mesuré la libération de cytokines pro-inflammatoires interleukine-8 (IL-8) dans le sang total humain et on a trouvé qu'en plus de CAP37, d'autres polypeptides cationiques riches en arginine, comme les petites protamines structurellement apparentées, d'améliorer l'activation des monocytes induite par le LPS. CAP37 et que les protamines partagent des niveaux élevés de teneur en arginine, nous avons testé le poly synthétique différent L - acides aminés et on a trouvé que le poly-arginine, et dans une moindre mesure, de poly - L-lysine, l'augmentation de la production d'IL-8 stimulée par LPS chez le sang total humain. Réponses de LPS protamine renforcée est restée non affectée par la présence d'arginine ou de lysine libre, ce qui indique que les polypeptides basiques, mais pas les acides aminés basiques agissent en synergie avec le LPS. En accord avec les observations précédemment rapportées pour CAP37, l'effet de LPS amélioration de l'arginine a été complètement L - poly - abolie anticorps blocage du récepteur humain LPS, CD14. Protamines, soit immobilisés ou en solution, liés LPS spécifiquement. arginines Polymers L-, protamines et CAP37 étaient également efficaces pour inhiber la liaison du LPS immobilisé arginines L-. Pris ensemble, nos résultats suggèrent un mécanisme de CD14-dépendante par lesquels les protéines cationiques riches en arginine modulent l'activation des monocytes induite par le LPS et soutiennent la prédiction que d'autres protéines fortement basiques pourraient agir comme des amplificateurs de réponses de LPS. Dans le plasma humain, Gram négatif endotoxine (lipopolysaccharide LPS) se forme rapidement un complexe à haute affinité avec la protéine de liaison au LPS (LBP) (32). Le complexe LPS-LBP résultant est reconnu par l'antigène de différenciation des monocytes CD14 ancrée glycosylphosphatidylinositol (16. 38). transduction du signal se fait par association de CD14 avec le récepteur Toll-like 4 (TLR4) (23). TLR4 active une voie de signalisation similaire mais pas identique à la (IL-1), la voie de l'interleukine-1, ce qui entraîne la production de nombreux médiateurs de l'inflammation, notamment facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a) (4). Bien que TNF - est d'une importance cruciale pour l'élimination de l'infection (12), la sécrétion de TNF excessive peut conduire à un choc septique et la mort (35). L'identification des cibles moléculaires dans l'activation des cellules induite par le LPS (5) a fourni une base rationnelle pour la conception de nouveaux médicaments de la septicémie, par exemple anticorps qui neutralisent ou LPS blocs, CD14 ou FNT. La plupart de ces agents antisepsie expérimentaux, cependant, n'a pas réussi à améliorer les résultats cliniques (14). Les difficultés rencontrées dans les tentatives de neutralisation du LPS effets sont illustrés par les propriétés opposées de deux PSL qui présente beaucoup d'identité de séquence, à savoir la lombalgie et la protéine bactéricide augmentant la perméabilité (BPI) (32). Considérant que LBP représente l'un des amplificateurs les LPS plus puissants, BPI possède LPS neutralisants puissants propriétés, ce qui réduit le TNF libérer induite par les bactéries gram-négatives (36). Cependant, en dépit favorable dans les résultats in vitro, BPI n'a pas émergé comme un médicament antisepsie (14. 15). CAP37, une autre LBP, attire les monocytes (7) et augmente la production induite par le LPS du TNF-a (18). Fait intéressant, la mutagenèse de la séquence LPS de liaison putatif de CAP37 (22) ne modifie pas le LPS de liaison ou induite par le LPS activation monocytaire (27), ce qui suggère que cette séquence LPS de liaison putatif peut ne pas être nécessaire à l'augmentation des réponses de LPS. Dans cette étude, nous avons cherché à identifier les éléments structuraux communs dans des polypeptides cationiques qui interviennent dans les effets de LPS-amélioration. Nous émettons l'hypothèse que les caractéristiques physico-chimiques, par exemple la présence de résidus d'acides aminés chargés plutôt que des motifs de séquence spécifiques, serait de déterminer si un polypeptide particulier possède des propriétés LPS améliorant. Nous avons constaté que divers d'origine naturelle ainsi que des polypeptides cationiques synthétiques renforcé par LPS a induit des réponses inflammatoires dans le sang total humain. Nous montrons que les effets stimulants de LPS divers polypeptides cationiques sont principalement médiés par des résidus d'arginine. Ces résultats mettent en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel les réponses de l'hôte à l'endotoxine gram-négatives sont modifiées. MATERIELS ET METHODES Réactifs. Histopaque-1077 Hybri-Max, un milieu RPMI 1640, une solution saline tamponnée au phosphate, Escherichia coli O111: B4 LPS, l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) LPS (LPS-FITC) conjugué au FITC héparine (héparine FITC), la poly L - l'acide glutamique, l'acide poly-L-aspartique, l'asparagine poly-L-tyrosine L-poly - L-lysine poly - L-arginine poly - L-lysine et l'albumine de sérum bovin d'agarose immobilisé (BSA), l'héparine, les protamines et L-arginine ont été achetés auprès de Sigma (St. Louis, MO). L - Arginine était de Merck (Darmstadt, Allemagne). Protamin 1000 (riche en arginine protéines à faible poids moléculaire de 100 UI de 1,0 mg) et Liquemin (sel de sodium de l'héparine non fractionnée 100 UI 0,625 mg) étaient de F. Hoffmann-La Roche (Bâle, Suisse). My4, un anticorps monoclonal murin neutralisant contre le CD14 humain a été acheté chez Coulter Corporation (Miami, Floride). CAP37 humaine recombinante (31) a été généreusement fourni par Hans Flodgaard (Leukotech, Copenhague, Danemark). dosage de sang total. le sang total humain a été obtenu auprès de donneurs sains et recueilli dans de l'EDTA et de l'acide Vacutainers-citrate-dextrose (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N. J.). le sang total citraté a été immédiatement dilué 1: 1 dans un milieu RPMI 1640. LPS, CAP37, protamines, l'héparine non fractionnée, les acides aminés poly-L-, L-lysine, L-arginine, ou d'anticorps monoclonaux MY4 ont été ajoutés comme il est décrit ailleurs dans le texte. Les échantillons ont été mis en incubation pendant 4 h à 37 ° C, et sécrétées IL-8 a été mesurée par un dosage immuno-enzymatique (ELISA). Chiffres de monocytes ont été déterminées dans le sang EDTA par le marquage endogène de la peroxydase et de l'analyse de cytométrie de flux (ADVIA120 Bayer Diagnostics, Munich, Allemagne). Lorsque cela est indiqué, les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été séparés des polynucléaires neutrophiles (PMN) par Histopaque-1077 centrifugation à gradient de densité comme décrit précédemment (26). ELISA. Après incubation à 37 ° C, des échantillons de sang entier dilué ont été centrifugés à 400 g pendant 5 min et les surnageants ont été recueillis et stockés à 20 ° C. plaques MaxiSorp surface Nunc-Immuno (Life Technologies Invitrogen, Bâle, Suisse) ont été recouvertes pendant une nuit à 4 ° C en tampon carbonate 0,1 M (pH 9,5) en utilisant un IL-8 anticorps anti-humain monoclonal (OptEIA) de Becton Dickinson PharMingen (Franklin Lakes , NJ). Les échantillons ont été décongelés et IL-8 concentrations ont été déterminées en utilisant un système de OptEIA (Becton Dickinson PharMingen). Un lecteur de microplaques Titertek Multiskan de ICN Pharmaceuticals Flow Laboratories (Costa Mesa, en Californie.) A été utilisé pour mesurer l'absorbance. Les concentrations de fibrinogène. thrombine bovine (NobiClot Fibrinogène Nobis, Endingen, Allemagne) ont été ajoutés à des échantillons de plasma dilués, et les temps de coagulation ont été déterminés mécaniquement au moyen d'un dispositif AMAX CS190 (Sigma). Les temps de coagulation ont été converties en concentrations de fibrinogène en utilisant une table de conversion fournie par Nobis. les temps de coagulation de la thrombine. les temps de coagulation de la thrombine ont été déterminées à l'aide de thrombine bovine à partir Diagnotec (Liestal, Suisse) en combinaison avec un dispositif AMAX CS190 (Sigma). Les mesures de fluorescence. Un total de 50 litres de billes d'agarose compactés conjugués à la BSA, l'héparine, les protamines ou arginines l - a été lavé dans du milieu RPMI 1640 et incubé avec ou sans 10 g d'héparine-FITC / ml et / ou 10 g de LPS-FITC / ml. Lorsque cela est indiqué, 10 g de poly-L-arginine / mL, 100 UI de protamines / ml, soit 100 g de CAP37 / ml a été ajouté et les échantillons ont été laissés pendant une nuit à 4 ° C dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10 sérum de veau foetal. des billes d'agarose ont été lavées abondamment dans du sérum physiologique tamponné au phosphate, et les niveaux de fluorescence liés ont été mesurés en utilisant un FLUOstar SLT lecteur de microplaques à fluorescence (Tecan Group Ltd. Männedorf, Suisse) ou un SPECTRAmax GÉMEAUX XS microplaques Spectrofluorometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). . Analyse statistique. Le numéro de l'échantillon, la valeur moyenne et écart-type de chaque groupe de données ont été utilisés pour effectuer une analyse unilatérale de la variance en utilisant Fishers probable test de différence des moindres carrés. Les valeurs P de 0,05 sont considérées comme significatives. RESULTATS CAP37 et améliorent les protamines induite par le LPS IL-8 dans le sang total humain. La capacité de la protéine CAP37 cationique pour améliorer la réponse de LPS a été démontré par la détection d'une production accrue de TNF dans les monocytes humains isolés (18. 19). Pour vérifier si ces résultats sont de pertinence physiologique, nous avons cherché à étudier les effets de CAP37 sur LPS induite par la production d'IL-8 dans le sang total. Nous avons d'abord établi les conditions dans lesquelles les monocytes mais pas les neutrophiles (13. 33) deviennent la principale source d'IL-8 dans le sang total LPS traité. Fractionnement à gradient de densité d'un échantillon de sang humain entier a montré que les PBMC sont en effet les cellules IL-8 produisant prédominantes lorsque de faibles concentrations de LPS et de courtes durées d'incubation sont utilisés. Les fractions enrichies soit avec des PBMC ou des PMN ont été traitées avec 10 ng / ml de LPS pendant 4 h. Les PBMC (10 6), dans un échantillon constitué de 85 lymphocytes et monocytes 15, libéré 1700 pg d'IL-8. Dans des conditions identiques, 10 6 PMN a produit 25 pg d'IL-8. Par conséquent, bien que 10 fois plus PMN étaient présents dans l'échantillon de sang, la contribution des PBMC à la production totale de l'IL-8 est restée dans une plage de 80 à 90. Ce résultat est conforme à celui d'un essai de sang total ultérieur, que l'on a observé une perte presque complète de LPS induit la production d'iL-8 en présence d'anticorps qui bloquent spécifiquement l'antigène de différenciation des monocytes (16) et le récepteur du LPS (32), CD14 (voir Fig. 5). Plusieurs autres résultats plaident en faveur d'une faible dose et à court terme de traitement LPS utilisés tout au long de cette étude. Tout d'abord, les effets directs de LPS peuvent être évalués uniquement pendant les premières heures de stimulation, à savoir avant le niveau maximal de la sécrétion d'IL-8 est atteinte (10). Des temps plus longs d'incubation conduisent à une accumulation de TNF-a et l'IL-1, dont les deux stimulent la libération d'IL-8 (11). D'autre part, dans les conditions décrites ci-dessus, les concentrations de LPS hautes et basses sont également efficaces dans la stimulation de la production d'IL-8. Normalized 10 5 monocytes (entre les individus en bonne santé, jusqu'à quintuples différences dans le sang périphérique monocytes chiffres sont fréquemment observés), 10 ng de LPS / ml conduit à la production de 210 160 pg d'IL-8 / ml alors que 1 g de LPS / ml a stimulé la libération de 250 à 200 pg d'IL-8 / ml pendant une période d'incubation de 4 h (n 5 donneurs). Enfin, les concentrations de LPS plasmatiques pertinentes telles que celles observées dans le choc septique sont au millimètre près nanogrammes-per-(37) plutôt que d'une gamme microgrammes-per-millimètre. Dans notre étude, l'IL-8 niveaux dans le sang total LPS stimulée ont été le résultat de la synthèse de novo par les monocytes et ne sont pas dues à une libération de préformé cellulaire associée IL-8 (28). Ceci a été démontré par l'inhibition complète de la induite par le LPS IL-8 en présence d'anticorps qui bloquent sélectivement monocyte CD14 (voir Fig. 5). Avoir des conditions établies dans lesquelles LPS activation des monocytes peut être étudiée dans le sang total, nous avons évalué d'abord l'effet de la présence de CAP37 sur LPS induite par IL-8. CAP37 seul n'a pas stimulé l'IL-8 de presse (Fig. 1 piste 3) cependant, si LPS et CAP37 ont été ajoutés simultanément, l'IL-8 sécrétion a augmenté de manière significative au-dessus des niveaux produits par l'addition de LPS seul (Fig. 1. 2 voies et 4 P 0,05). Ces résultats suggèrent un rôle possible pour les résidus arginine dans l'amélioration des signaux LPS. Effet des protéines riches en arginine cationiques induite par le LPS sur la production d'IL-8 dans le sang total humain. le sang total citraté provenant de donneurs sains a été dilué 1: 1 avec du milieu RPMI 1640 et laissée non traitée ou traitée pendant 4 h avec du LPS (10 ng / ml), CAP37 (25 g / ml) et Protamin (protamines 100 UI / ml). IL-8 ont été mesurés par ELISA. Les valeurs sont des moyens écarts-types (n 4 donateurs) par rapport, P 0,05. formation d'un complexe d'héparine avec des protamines améliore encore induite par le LPS IL-8. Héparine, un hydrate de carbone polysulfaté, est largement utilisé dans la pratique clinique pour inhiber la coagulation. Protamines, qui forment des complexes de haute affinité avec de l'héparine (24), sont également utilisés cliniquement pour neutraliser les effets anticoagulants héparines. Des études antérieures ont montré que l'héparine augmente induite par le LPS activation des monocytes (20). Des données plus récentes suggèrent que cette amélioration est médiée par des résidus héparines de sulfate (M. Heinzelmann et H. Bosshart, soumis pour publication). Nous avons vérifié si l'héparine et protamines auraient chacun neutraliser l'effet LPS-amélioration de l'autre lorsqu'ils sont additionnés au sang total humain. Lorsqu'il est ajouté seul, à la fois l'héparine et les protamines augmenté induite par LPS de IL-8 (Fig. 2A. Les pistes 4 et 6 P 0,05), suggérant que l'héparine et les protamines améliorent les effets du LPS par des mécanismes différents. Effet des complexes héparine-protamine sur le LPS induit la libération d'IL-8 dans le sang total humain. sang total citraté de donneurs sains a été dilué 1: 1 avec du milieu RPMI 1640 et gauche non traitées ou traitées pendant 4 h avec LPS (10 ng / ml), Liquemin (héparine 10 ou 100 UI / ml), et Protamin (protamines 100 UI / ml barres noires). (A) Les niveaux d'IL-8 ont été mesurées par ELISA. Les valeurs sont des moyens écarts types (n 4 donateurs) par rapport et contre, P 0,05. Afin de démontrer que l'addition simultanée de l'héparine et les protamines donne des complexes héparine-protamine, nous avons examiné les effets des mélanges d'héparine-protamine sur les paramètres de la coagulation. Comme jugé par un allongement des temps de coagulation de la thrombine, 10 ou 100 UI d'héparine / ml de coagulation inhibée efficacement dans le sang total humain (Fig. 2B. Les pistes 1 à 3). La présence de LPS, que ce soit seul ou en combinaison avec de l'héparine, n'a eu aucun effet sur les temps de coagulation de la thrombine (Fig. 2B. Les pistes 1 à 6). En accord avec les rapports précédents (8), les protamines seul n'a pas d'incidence sur les temps de coagulation de la thrombine (Fig. 2B. Voie 7). L'addition de protamines à des échantillons d'héparine restaurée fois la thrombine de la coagulation au niveau initial (Fig. 2B. Pistes 1 et 4 et les pistes 7 à 10), ce qui démontre un effet neutralisant l'héparine de protamines qui, à son tour, dépend de la formation de complexes l'héparine avec des protamines. Mesure des concentrations de fibrinogène plasmatiques ont confirmé ces résultats. Avec ou sans LPS, l'addition d'héparine a entraîné une réduction du taux de fibrinogène (Fig. 2C. Les pistes 1 à 3 et les voies 4 à 6, P 0,05). Lors de l'héparine et les protamines sont combinées, les taux de fibrinogène sont restés inchangés (Fig. 2C. Pistes 9 et 10). L-arginine synthétique poly-L-lysine et la poly sont des amplificateurs puissants de LPS induit la production d'IL-8. Après avoir montré que différentes protéines naturelles cationiques riches en arginine améliorent induite par le LPS IL-8, nous avons ensuite demandé si la présence de résidus chargés positivement, par exemple lysine ou arginine, dans les chaînes polypeptidiques était suffisante pour améliorer les signaux de LPS. A cette fin, nous avons ajouté, conjointement avec le LPS, divers acides aminés poly-L - synthétiques pour le sang total humain dilué et contrôlé plasmatiques d'IL-8. La présence d'acide glutamique chargé négativement ou poly-L-aspartique L-poly n'a eu aucun effet sur le LPS induit la production d'IL-8 (Fig. 3. Les pistes 2, 4 et 6). De même, l'asparagine et la tyrosine poly-L - L - poly - deux acides aminés poly-L - neutres, ne pas interférer avec l'activation des monocytes du LPS (Fig. 3. Les voies 2, 8 et 10). L'addition de L-lysine ou poly-L-arginine poly Cependant, l'augmentation induite par le LPS production d'IL-8 de façon significative (fig. 2, 3. Les voies 12 et 14 P 0,05), avec l'arginine poly-L - émergeant comme l'amplificateur le plus puissant des réponses de LPS. Ces données ont montré que les effets LPS-stimulants de polypeptides de base ont été associés à des résidus arginine ou lysine chargés positivement. Effet des acides aminés poly-L - synthétiques sur la production d'IL-8 dans le sang entier humain stimulé par le LPS. le sang total citraté provenant de donneurs sains a été dilué 1: 1 avec du milieu RPMI 1640 et on traite pendant 4 h avec du LPS (10 ng / ml) et / ou poly-amino-acide l - (Xn 10 g / ml), seul ou en poly l'acide L-glutamique (E), le poly acide L-aspartique (D), le poly asparagine l - (N), la tyrosine poly L - (Y), le poly L - lysine (K) ou poly L - l'arginine (R). IL-8 ont été mesurés par ELISA. Les valeurs sont des moyens écarts-types (n 4 donateurs) par rapport, P 0,05. lysine libre et L - libre arginine ne touchent pas induite par le LPS IL-8. Pour étudier davantage le rôle de lysine et les résidus d'arginine dans l'activation LPS, nous avons testé les effets de la lysine libre et arginine libre dans le sang total LPS-stimulé. A une concentration de 1 mg / ml, L - lysine et l'arginine n'a pas augmenté induite par le LPS IL-8 de façon significative (fig. 4. Les pistes 2, 4 et 6). Pour tester si les acides aminés L - libres en concurrence avec les acides aminés L - polypeptidiques-résident correspondants, nous avons mélangé protamines avec excès arginine libre ou lysine et mesuré l'effet sur l'IL-8 de presse après stimulation par le LPS. Protamines amplifiées réponses LPS indépendamment de lysine libre ou arginine était présent (Fig. 4. voies 7, 8 et 9). Des résultats similaires ont été obtenus lorsque CAP37, lysine poly - ou poly-L-arginine a été utilisée au lieu de protamines (données non présentées). Ces résultats indiquent que les polypeptides de base, mais les acides aminés, de fonction comme améliorateurs de signaux de LPS pas de base. Effet de l'arginine et de lysine libre de droits sur l'amélioration de la protamine à médiation par du LPS induit la production d'IL-8 dans le sang total humain. le sang total citraté provenant de donneurs sains a été dilué 1: 1 avec du milieu RPMI 1640 et laissée non traitée ou traitée pendant 4 h avec du LPS (10 ng / ml), de L-lysine libre (K 1 mg / ml), de L-arginine libre (R 1 mg / ml) et Protamin (protamines 100 UI / ml). IL-8 ont été mesurés par ELISA. Les valeurs sont des moyens écarts-types (n 4 donateurs) par rapport, P 0,05. Le blocage du récepteur de LPS humain, CD14, supprime l'effet d'arginine poly - sur l'amplification induite par LPS de IL-8. Des travaux récents ont montré que le blocus d'anticorps de CD14 inhibe l'amélioration CAP37-médiation de la production de TNF induite par le LPS dans les monocytes humains isolés (19). Nous avons examiné si l'amélioration de la LPS réponses par arginine poly a montré une CD14 dépendance similaire. Après préincubation de sang entier humain avec MY4, un anticorps monoclonal murin neutralisant contre le CD14 humain, le LPS n'induit la production d'IL-8 (Fig. 5. Les voies 2 et 6). Ce résultat a fourni des preuves concluantes que les monocytes étaient en effet la principale source d'IL-8 induite par le LPS dans notre test de sang total. Comme indiqué précédemment (fig. 2 et 3. Les couloirs 14), l'arginine poly-L - améliorée induite par le LPS IL-8 (Fig. 5. Les pistes 2 et 4), mais un prétraitement avec MY4 complètement aboli cet effet (Fig. 5. pistes 4 et 8). Ces observations ont exclu l'implication des récepteurs de LPS alternatifs tels que CD11b / CD18 (21. 30) ou les récepteurs scavenger (17) dans la médiation de l'amélioration induite par le poly L - arginine de réponses de LPS. Effet de l'anticorps CD14 blocage sur l'amélioration de la poly-L - arginine induite par du LPS induit la production d'IL-8 dans le sang total humain. le sang total citraté provenant de donneurs sains a été dilué 1: 1 avec du milieu RPMI 1640 et laissée non traitée ou pré-incubées pendant 1 h à température ambiante avec des anticorps anti-CD14 de souris monoclonaux (MY4 10 g / ml). Les échantillons ont été ensuite laissées non traitées ou traitées pendant 4 heures avec du LPS (10 ng / ml) et / ou poly-L - arginine (R 10 g / ml). IL-8 ont été mesurés par ELISA. Les valeurs sont des moyens écarts types (n 4 donneurs) par rapport, par rapport, par rapport, P 0,05. Les protamines sont LBPs. Nous avons ensuite examiné si les protamines se lient spécifiquement LPS. des billes d'agarose portant soit BSA anioniques ou cationiques, les protamines ont été équilibrées avec de l'héparine-FITC (Fig. 6A) ou du LPS-FITC (Fig. 6B). Ni l'héparine-FITC, ni LPS-FITC lié à BSA-agarose spécifique (Fig. 6A et B, les pistes 1 et 2). Comme prévu, l'héparine-FITC a montré une nette affinité pour les protamines (Fig. 6A. Voies 3 et 4). Il est intéressant de LPS-FITC a également présenté une affinité pour les protamines (fig. 6B. Pistes 3 et 4). Cette conclusion a été vérifiée par une série d'expériences supplémentaires. En premier lieu, la liaison de LPS à FITC protamines était saturable et est inhibée par l'addition d'un excès de LPS non conjugués (Fig. 6C). D'autre part, la liaison de LPS à FITC protamines immobilisées a été inhibée par l'addition de protamines solubles (fig. 6D. Les pistes 1 et 2). Enfin, le LPS-FITC a été recrutée sur héparine immobilisée par l'addition de protamines solubles (fig. 6D. Les pistes 3 et 4). Une autre preuve que l'arginine résidus sont impliqués de manière critique dans la liaison de LPS a été obtenue par incubation de arginines L - agarose immobilisé avec le LPS-FITC en présence ou en l'absence de différentes structures riches en arginine (Fig. 6E). arginines poly L-, les protamines et CAP37 étaient efficaces pour inhiber l'interaction du LPS-FITC avec des arginines L - immobilisées (Fig. 6E. pistes 3, 4 et 5). Ces observations suggèrent que les résidus arginine médiation LPS de liaison à l'arginine-riches polypeptides cationiques. La liaison du LPS-FITC à des protamines. agarose tassé (50 litres) avec de la BSA liée de manière covalente (BSA-agarose), de l'héparine d'agarose immobilisé (héparine-agarose) ou des protamines d'agarose immobilisé (protamine-agarose) ont été incubées avec de l'héparine-FITC ou LPS-FITC en présence ou l'absence de poly-L-arginine (R), les protamines ou CAP37. des billes d'agarose ont été lavées, et les niveaux de fluorescence liés ont été déterminés comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les valeurs sont des moyennes et des écarts-types sont exprimés en pourcentage de la fluorescence maximale (N 3 échantillons). (A) La liaison de l'héparine soluble dans FITC à des protamines immobilisés. (B) La liaison de LPS solubles FITC protamines immobilisés. (C) Saturation et de la concurrence de LPS-FITC se liant à protamines immobilisés. Pour mettre en évidence le déplacement de la protamine liée au LPS FITC, on a ajouté 500 g de LPS / ml, avec 5 g de LPS-FITC / ml. (D) La liaison de LPS-FITC à la forme soluble protamines. L'addition de protamines solubles a conduit au déplacement de LPS-FITC de protamines immobilisés (1. 2). protamines solubles capture LPS-FITC en solution (3. 4). (E) la concurrence du LPS-FITC se liant à arginines L - immobilisés. Les structures diverses riches en arginine (Rn), les protamines et tous CAP37 inhibent l'interaction entre les LPS-FITC et arginines L - immobilisés. DISCUSSION La liaison du LPS a été décrite précédemment pour la pleine longueur CAP37 (29), ainsi que d'un peptide synthétique correspondant à résidus d'acides aminés 20-44 de CAP37 (6). effets des réponses inflammatoires LPS-induites Améliorer, d'autre part, ont été signalés pour toute la longueur CAP37 (18. 19), mais pas pour le CAP37 dérivé court LPS-peptide de liaison (6). La résolution de la structure de CAP37 a révélé que la plupart des résidus basiques sont regroupées et forment un patch cationique (22). Les effets LPS-stimulants de CAP37 pourraient, en théorie, être liés à une abondance de résidus basiques cependant, cela est difficile à prouver, parce que la mutagénèse ciblée des résidus arginine modifierait 10 de la protéine entière. Dans la présente étude, nous apportons la preuve que, dans un système physiologique intact tel que le sang total humain, les effets LPS-améliorant peuvent être causées par de nombreux polypeptides cationiques. Nous avons identifié des résidus basiques d'acides aminés, en particulier, des arginines en tant qu'élément structurel commun, capable de médier l'amélioration de LPS. Les protamines sont un groupe de petites protéines nucléaires de base riches en arginine et de sperme fortement cationique qui remplacent les histones dans l'emballage des chromosomes à un stade tardif de la spermatogenèse (1). Protamines sont également utilisés cliniquement pour neutraliser les effets anticoagulants de l'héparine, un glycosaminoglycane polysulfaté mastocytes avec une capacité à améliorer l'activation des monocytes induite par le LPS (20). L'observation selon laquelle l'héparine et les protamines ne neutralisent pas les effets de LPS amélioration (Fig. 2) indique que les structures tertiaires complexes à la fois de l'héparine et les protamines sont pas d'une importance cruciale pour l'amélioration de LPS. Une analyse plus poussée a montré que la présence d'arginine synthétique ou des polymères de L-lysine améliorée des réponses de LPS d'une manière similaire à celle de la ou des protamines CAP37 (fig. 3). Comme acides L - acides poly chargés existent seulement dans les bobines aléatoires (9), notamment des structures secondaires sont peu susceptibles de jouer un rôle dans l'amélioration de la LPS arginine-médiée. L'élimination complète des poly-L - arginine LPS réponse améliorée lors de l'anticorps blocage de CD14 (Fig. 5), combiné avec le fait que immobilise arginines LPS se lient l - (fig. 6), les points à un mécanisme dans lequel LPS est capturé par des polypeptides basiques en solution avant l'activation CD14 dépendant des monocytes. Il est important de souligner que la mise en valeur du LPS n'a pas été déterminée par l'abondance d'un acide aminé basique seul particulier. Par exemple, l'albumine sérique, une protéine plasmatique abondante, contient plus de résidus arginine et la lysine que CAP37 humaine et 2B protamine de saumon combiné (Fig. 7). Toutefois, l'albumine sérique est globale anionique et n'a aucune incidence sur les réponses de LPS. Bien que les expériences présentées ici plaident fortement en faveur d'un rôle de résidus arginine en conférant LPS améliorant les propriétés cationiques polypeptides, ils ne pas exclure la possibilité que certains polypeptides anioniques sont capables de sensibiliser les cellules hôtes au LPS. PSL et CD14, ainsi que le domaine extracellulaire du TLR4, sont toutes nécessaires pour l'initiation de réponses de LPS, mais les formes humaines de ces protéines sont les tensioactifs anioniques (fig. 7). Un autre exemple est l'hémoglobine liaison du LPS à la cellule-libre (25), qui ne comporte pas des interactions électrostatiques, ce qui indique que les résidus arginine pourraient ne pas être impliqués. La présence d'hémoglobine libre, cependant, est suffisante pour améliorer les réponses de LPS (25) et d'augmenter la mortalité chez les animaux de laboratoire ayant une péritonite induite (34). Propriétés physicochimiques de LBPs. Anionique CD14 humaine (hCD14) et LBP humaine (hLBP) LPS se lient et conférer la réactivité à la présence de faibles concentrations de LPS. En présence de LPS, les domaines extracellulaire du TLR4 (hTLR4 e) interagissent avec CD14 et initier l'activation cellulaire. L'albumine humaine sérique (HSA), une protéine plasmatique abondante riche en résidus basiques (K, L - lysine R, arginine), mais avec une charge globale négative, ne se lie pas LPS ou interférer avec l'activation LPS. CAP37 Cationic humain (hCAP37) ou protamine de saumon 2B (sProtamine 2B) se lie LPS et amplifie les réponses de LPS. Les positions le long de l'axe y représente la somme des résidus basiques pour chaque protéine. frais relatifs globaux de protéines (numéro de la charge nette: anionique, ouvert cercles cationiques, cercles fermés) représentent les différences entre positivement (K R) et négativement (acide glutamique et l'acide aspartique) résidus chargés. Non représenté sont possibles modifications post-traductionnelles telles que l'ajout de résidus d'acides ou de sulfate sialique chargés négativement. Sur la base des conclusions concernant l'une homologie de séquence des formes humaines de BPI et LBP (32) et la structure cristalline a récemment résolu de BPI (2), Beamer et ses collègues ont prédit un cluster de base près de l'extrémité N-terminale de la lombalgie (3). Les auteurs de ces travaux ont en outre suggéré que les résidus qui forment ce groupe de base peuvent être libres d'interagir avec les groupes phosphate chargés négativement dans la partie lipide A du LPS si elles ne sont pas engagés dans les interactions interresidue (3). En théorie, les polypeptides riches en arginine cationiques (par exemple protamines) sont plus susceptibles de contenir des clusters de base sans fonction structurelle, ce qui pourrait expliquer pourquoi certains de ces polypeptides se lient LPS et améliorer les réponses de LPS. arginines L - poly - synthétiques ou lysines L - poly représentent des exemples extrêmes de polypeptides cationiques, parce que tous les résidus arginine ou lysine sont libres d'interagir avec des groupes chargés négativement (par exemple les groupes de phosphate de LPS). LBP, la protéine du LPS améliorant la plus puissante, se lie LPS et transfère LPS à CD14 (38) spécifiquement. CAP37 humain a des affinités avec les LPS (22) et des monocytes (18), mais ne reconnaît pas spécifiquement le CD14 (18). lysines L - Polymers, d'autre part, ne reconnaissent pas spécifiquement monocytes mais se lient à toutes les surfaces cellulaires. La liaison de lysines aux cellules poly-L - est largement utilisé pour induire l'attachement des cellules non adhérentes à des surfaces de poly - lysine revêtu L-. Liaison des complexes polypeptide-LPS cationiques monocytes peut être suffisante pour faciliter le transfert de LPS CD14, ce qui entraîne des réponses améliorées de LPS. REMERCIEMENTS Nous remercions les bénévoles qui ont participé à cette étude. Nous remercions tout particulièrement Jan A. Fischer (Laboratoire de recherche en métabolisme du calcium, Balgrist University Hospital Orthopédie, Zurich, Suisse) pour son généreux soutien. Cette étude a été financée en partie par Novartis (subvention no. 99C45), la Fondation de recherche Mayenfisch Olga (subvention. Pas 232042), et la Commission de recherche AO (accorder aucune. 2000 H23). FOOTNOTES reçu 22 Juillet 2002. 19 Septembre 2002. Accepted auteur correspondant. Adresse postale: Département de chirurgie, Hôpital universitaire, Ramistrasse 100, CH-8091 Zurich, Suisse. Téléphone: 41 1 255 1111 Fax: 41 1 255 4198. E-mail: bluewin. ch mheinzelmann. Sous la direction de: S. H. E. Kaufmann RÉFÉRENCES Ausio, J. 1999. Histone H1 et l'évolution des protéines nucléaires de base de sperme. J. Biol. Chem. 274: 31115 -31118. Beamer, L. J. S. F. Carroll, et D. Eisenberg. 1997. La structure cristalline de la BPI humaine et deux phospholipides liés à une résolution de 2,4 angström. Sciences 276: 1861 -1864. Beamer, L. J. S. F. Carroll, et D. Eisenberg. 1998. La famille BPI / LBP des protéines: une analyse structurelle des régions conservées. Protein Sci. 7: 906 -914. Beutler, B. 2000. Tlr4: composante centrale de la semelle capteur de LPS mammifère. Curr. Opin. Immunol. 12: 20 -26. Beutler, B. 2000. endotoxine, récepteur Toll-like 4, et la branche afférente de l'immunité innée. Curr. Opin. Microbiol. 3: 23 -28. Brackett, D. J. M. R. Lerner, M. A. Lacquement, R. Il, et H. A. Pereira. 1997. Un peptide synthétique de lipopolysaccharide de liaison basée sur la protéine CAP37 neutrophiles dérivée empêche les réponses induites par une endotoxine chez les rats conscients. Infecter. Immun. 65: 2803 -2811. Chertov, O. H. Ueda, L. L. Xu, K. Tani, W. J. Murphy, J. M. Wang, O. M. Howard, T. J. Sayers, et J. J. Oppenheim. 1997. Identification du neutrophile humain dérivé de la cathepsine G et azurocidin / CAP37 comme agents chimio-attractifs pour les cellules mononucléaires et polynucléaires neutrophiles. J. Exp. Med. 186: 739 -747. Chu, A. J. Z. G. Wang, M. Raicu, S. Beydoun, et N. Ramos. 2001. protamine inhibe le facteur tissulaire de coagulation extrinsèque initié. Br. J. Haematol. 115: 392 -399. Cuff, J. A. et G. J. Barton. 2000. Application de plusieurs profils d'alignement de séquences pour améliorer la protéine de prédiction de la structure secondaire. Les protéines 40: 502 -511. DeForge, L. E. et D. G. Remick. 1991. Kinetics du TNF, l'IL-6 et IL-8 dans l'expression des gènes stimulés par le LPS du sang humain entier. Biochem. Biophys. Res. Commun. 174: 18 -24. Nat. Biotechnol. Ann. Nat. Biochim. Biophys. Proc. Acad. Sci. Un m. J. Clin. American Society for Microbiology